Глава 2. Молекулярные основы наследственности Представьте себе, что увеличили человека до размеров Великобритании, тогда клетка будет иметь размер фабричного здания. Внутри клетки находятся содержащие тысячи атомов молекулы, в том числе молекулы нуклеиновой кислоты.

Глава 2. Молекулярные основы жизни Фундаментальную роль в структуре живой материи играет первый уровень ее организации – молекулярный. На этом уровне анализируются химические вещества, составляющие живой организм, взаимосвязь их структуры и функции.Все имеющиеся в

Денатурация, причины и признаки, использование в медицине.

Белки чувствительны к внешним воздействиям. Нарушение пространственной структуры белков называют денатурацией. При этом белок теряет все свои биологические и физико-химические свойства. Денатурация сопровождается разрывом связей, стабилизирующих "нативную" структуру белка. Как уже отмечалось выше, в основе стабилизации структуры белков основную роль играет слабое взаимодействие, поэтому денатурацию могут вызывать различные факторы: нагревание, облучение, механическое встряхивание, охлаждение, химическое воздействие. При денатурации, как правило, нарушается и растворимость белков, так как нарушение структуры приводит к появлению на поверхности большого числа гидрофобных групп, обычно упрятанных в центре белковой молекулы.

Первичная структура белка при денатурации не изменяется, что позволило показать возможность восстановления функций и структуры денатурированного белка, хотя в большинстве случаев денатурация является необратимым процессом . В лабораторной практике денатурация используется для депротеинизации биологических жидкостей. Факторы, вызывающие денатурацию, называют денатурирующими агентами. К ним можно отнести:

1. Нагревание и действие облучения высоких энергий (ультрафиолетовое, рентгеновское, нейтронное и т.д). В основе лежит возбуждение колебаний атомов, сопровождающееся разрывом связей.

2. Действие кислот и щелочей; изменяют диссоциацию групп, уменьшают число ионных связей.

3. Ионы тяжелых металлов. Образуют комплексные соединения с группами белка, что сопровождается разрывом слабого взаимодействия.

4. Восстановители - вызывают разрыв дисульфидных мостиков.

5. Мочевина, гуанидиний хлористый - формируют новые водородные связи и разрывают старые. Явление денатурации можно использовать и для качественного анализа присутствия белков в растворах. Для этого пользуются пробой с кипячением исследуемой жидкости после ее подкисления. Образующееся при этом помутнение связано с денатурацией белка. Часто используют и осаждение органическими кислотами: сульфосалициловой или трихлоруксусной.

Краткая история энзимологии.

Присуждением Нобелевской премии Дж Самнеру, Дж. Нортропу и Стенли в 1946 г была подведена черта длительному периоду развития энзимологии – науки о ферментах. Начало этой науки восходит к заре истории развития человечества, использующего ряд технологических ферментативных процессов в своей жизни: хлебопечение, виноделие, обработка шкур животных и т.д. Потребность совершенствования этих процессов стало побудительным началом для их углубленного исследования. К первым научным описаниям ферментативных процессов относится описание пищеварения у животных Рене Антуан реомюр (1683-1757) при постановке своих экспериментов исходил из сделанного Фолкнером предположения о том, что хищные птицы отрыгивают не переваренные остатки пищи. Реомюр сконструировал маленькую проволочную капсулу, в которую был положен кусок мяса и дал ее склевать сарычу. Через 24 часа птица выплюнула эту капсулу. В ней остался размягченный кусок пиши, который однако не портился. «Этот процесс может быть только результатом действия какого-то растворителя»,- заключил Реомюр. Лаззаро Спалланцани (1729-1799), профессор истории естествознания в Университете города Падуя, сообщал о подобных же экспериментах. Однако он не рассматривал пищеварение как процесс ферментации по той простой причине, что при этом не образовывались пузырьки газа.

Позже процесс ферментации был более подробно изучен одним из основоположников современной химии Антуаном Лораном Лавуазье (1743-1794). Изучая спиртовое брожение, происходящее при изготовлении вина, он обнаружил, что глюкоза превращается в спирт и углекислый газ,

К началу XIX в. преобладала общая точка зрения, что ферментация - это химические изменения, вызываемые некоторыми специальными формами органического материала, а именно «ферментами». В 1814 г. русский ученый (немец по происхождению) академик Петербургской Академии наук Константин Готлиб Сигизмунд Кирхгоф (1764-1833) показал, что образование сахара из крахмала в проросших зернах злаков обусловлено химическим процессом, а не появлением ростков. В 1810 г Ю. Гей-Люссак выделил основные конечные продукты жизнедеятельности дрожжей – спирт и углекислый газ. Я. Берцелиус, один из основоположников теории химического катализа и автор самого термина «катализ» в 1835 году подтверждает эти данные, отметив, что диастаза (экстракт из солода) катализирует гидролиз крахмала более эффективно, чем минеральная серная кислота. Важную роль в развитии энзимологии сыграл спор Ю Либиха с известным микробиологом Л. Пастером, который считал, что процессы ферментации могут происходить только в целой живой клетке. Ю. Либих, напротив, считал, что биологические процессы вызываются действием химических веществ, которые в последствии были названы ферментами. Термин энзим (греч. еn – в, zyme - дрожжи) предложил 1878 г Фридрих Вильгельм Кюне чтобы подчеркнуть, что процесс идет в дрожжах в противоположность самим дрожжам, которые катализируют процесс ферментации. Однако в 1897 году Э. Бюхнер получил свободный от клеток экстракт из дрожжей, способный получать этанол и утвердил мнение Либиха.

Попытки объяснить одно из важных свойств ферментов специфичность привело в 1894 году немецкого химика и биохимика Э. Фишера к предложению модели взаимодействия фермента и субстрата, названной «ключ-замок» – геометрической комплементарности форм субстрата (ключ) и фермента(замок). В 1926 году Дж. Самнер после почти 9-летених исследований доказал белковую природу фермента уреазы. В те же годы Дж Нортроп и М Кунитц указали на прямую корреляцию между активностью кристаллических пепсина, трипсина и количеством белка в исследуемых образцах, приведя тем самым весомые доказательства белковой природы ферментов, хотя окончательные доказательства были получены после определение первичной структуры и искусственного синтеза ряда ферментов. Основные представления о ферментах получены уже во второй половине ХХ столетия. В 1963 году исследована аминокислотная последовательность РНКазы из поджелудочной железы. В 1965 г показана пространственная структура лизоцима. За последующие годы очищены тысячи ферментов и получено много новых данных о механизмах действия ферментов, их пространственной структуре, регуляции реакций, катализируемых ферментами. Обнаружена каталитическая активность у РНК (рибозимы). Получены антитела с ферментативной активностью –абзимы. Эта глава кратко знакомит с современными представлениями о строении, механизме действия и медицинских аспектах энзимологии.

Особенности ферментативного катализа.

1. Белковая природа катализатора

2. Исключительно высокая эффективность. Эффективность биологического катализа превышает эффективность неорганического в 10 9 - 10 12

3. Исключительно высокая специфичность:

а) абсолютная, когда фермент работает только со своим субстратом (фумараза с транс-изомерами фумаровой кислоты и не будет с цис-изомерами);

б) групповая - специфичен для узкой группы родственнных субстратов (ферменты ЖКТ).

4. Работает в мягких условиях (t=37, рН 7.0, определенные осмолярность и солевой состав).

5. Многоуровневая регуляция: регуляция активности на уровне условий среды, на уровне метаболона, на генетическом уровне, тканевом, клеточном, с помощью гормонов и медиаторов, а также с помощью субстратов и продуктов той реакции, которую они катализируют.

6. Кооперативность: ферменты способны организовывать ассоциации - продукт 1-го фермента, является субстратом для 2-го; продукт 2-го - субстратом для 3-го и т.д.

Кроме того, ферменты обладают адаптивностью, т. е. могут изменять свою активность и образовывать новые ассоциации.

7. Способны катализировать как прямую так и обратную реакцию. Направление реакции для многих ферментов определяется соотношением действующих масс.

8. Катализ жестко расписан, т. е. происходит поэтапно.

Специфичность действия ферментов.

Высокая специфичность ферментов обусловлена, конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурой активного центра фермента, обеспечивающими «узнавание», высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции.

В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной или групповой специфичностью и с абсолютной специфичностью.

Для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Так например, пепсин, расщепляет белки животного и растительного происхождения, хотя они могут отличаться по химическому строению, а/к составу, физиологическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы и жиры. Это объясняется тем, что местом действия пепсина является пептидная связь. Для действия липазы таким местом является сложно-эфирная связь жиров.

Т. е. эти ферменты обладают относительной специфичностью.

Абсолютной специфичностью действия называют, способность фермента катализировать превращение только единственного субстрата и любые изменения в структуре субстрата делают его недоступным для действия фермента. Например: аргиназа, расщепляющая аргинин; уреаза, катализирующая распад мочевины.

Имеются доказательства существования стереохимической специфичности, обусловленной существованием оптически изомерных L- и D- форм или геометрических (цис- и транс-) изомеров

Так известны оксидазы L и D а/к.

Если какое-либо соединение существует в форме цис- и трансизомеров, то для каждой из этих форм, существует свой фермент. Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс-), но не действует на цис-изомер - малеиновую кислоту.

Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс. При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и молекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное состояние , - высокоэнергетическая промежуточная структура, которая энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важнейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабилизации переходного состояния -взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации. Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного состояния соответствует свободной энергии активации (ΔG #). Скорость реакции зависит от величины (ΔG #) : чем она меньше, тем больше скорость реакции, и наоборот. По сути DG представляет собой «энергетический барьер», который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образовавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.

Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реакции.

1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизости друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения ).

2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фиксация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических связей ориентация (эффект ориентации ).

3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки (существует на растворенных в воде веществах).

4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.

5. Стабилизация переходного состояния.

6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать кислотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофильный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).

Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гликозидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим представляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной полипептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгеноструктурный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов, образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «щели» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести сахарных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F) (рис. 6.4).

Молекула муреина удерживается в активном центре лизоцима в основном благодаря водородным связям и гидрофобным взаимодействиям. В непосредственной близости к месту гидролиза гликозидной связи расположены 2 аминокислотных остатка активного центра: глутаминовая кислота, занимающая 35-е положение в полипептиде, и аспарагиновая кислота - 52-е положение в полипептиде (рис. 6.5).

Боковые цепи этих остатков располагаются на противоположных поверхностях «щели» в непосредственной близости к атакуемой гликозидной связи - примерно на расстоянии 0,3 нм. Остаток глутамата находится в неполярном окружении и не ионизирован, а остаток аспартата- в полярном окружении, его карбоксильная группа депротонирована и участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей.

Процесс гидролиза осуществляется следующим образом. Протонирован карбоксильная группа остатка Glu-35 предоставляет свой протон гликозидному атому кислорода, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С 1 -атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D (стадия общего кислотного катализа). В результате образуется продукт, включающий в себя сахарные кольца, находившиеся в участках E и F, который может высвободиться из комплекса с ферментом. Конформация сахарного кольца, расположенного в участке D, искажается, принимая конформацию полукресла , в которой пять из шести атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Эта структура соответствует конформации переходного состояния. При этом С 1 -атом оказывается положительно заряженным и промежуточный продукт носит название карбоний-иона (карбкатиона). Свободная энергия переходного состояния уменьшается за счет стабилизации карбоний-иона депротонированной карбоксильной группой остатка Asp-52 (рис. 6.5).

На следующем этапе в реакцию вступает молекула воды, которая замещает диффундирующий из области активного центра дисахаридный остаток. Протон молекулы воды переходит к Glu-35, а гидроксильный ион (ОН -) к атому С 1 карбоний-иона (стадия общего основного катализа). В результате второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реакции (конформация кресла) и уходит из области активного центра, а фермент возвращается в исходное состояние и готов осуществить следующую реакцию расщепления дисахарида (рис.6.5).

Свойства ферментов

Характеризуя свойства ферментов, в первую очередь оперируют понятием «активность». Под активностью фермента понимают такое его количество, которое катализирует превращение определенного количества субстрата в единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (Е) и «катал» (кат). За международную единицу активности фермента принято то его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 мин в стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моль субстрата за 1 с. 1 кат=6*10 7 Е.

Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью, которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность - это число единиц активности фермента на 1 мг белка.

Активность ферментов в очень сильной степени зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН среды. Повышение температуры в интервале 0-50° С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением процессов формирования субстрат-ферментного комплекса и всех последующих событий катализа. Однако дальнейшее повышение температуры, как правило, сопровождается увеличением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом - значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его активность. Чаще для ферментов растительного происхождения температурный оптимум лежит в пределах 50-60° С, а животного - между 40 и 50° С. Ферменты термофильных бактерий характеризуются очень высоким температурным оптимумом.

Зависимость активности ферментов от значений рН среды также имеет сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого оптимума в одну либо другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента (уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа).

Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (вещества, снижающие активность) и активаторов (вещества, увеличивающие активность). Роль ингибиторов и активаторов могут выполнять катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др. Эти вещества могут попадать в клетку извне либо вырабатываться в ней. В последнем случае говорят о регуляции активности ферментов - неотъемлемом звене в общей регуляции метаболизма.

Воздействующие на активность ферментов вещества могут связываться с активным и аллостерическим центрами фермента, а также вне этих центров. Частные примеры подобных явлений будут рассмотрены в главах 7- 19. Для обобщения некоторых закономерностей ингибирования активности ферментов следует указать, что эти явления в большинстве случаев сводятся к двум типам - обратимому и необратимому. В ходе обратимого ингибирования в молекулу фермента не вносится каких-либо изменений после его диссоциации с ингибитором. Примером служит действие аналогов субстрата , которые могут связываться с активным центром фермента, препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом. Однако увеличение концентрации субстрата приводит к «вытеснению» ингибитора из активного центра, и скорость катализируемой реакции восстанавливается (конкурентное ингибирование ). Другой случай обратимого ингибирования представляет собой связывание ингибитора с простетической группой фермента, или апоферментом , вне активного центра. Например, взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам остатков аминокислот фермента, белок-белковые взаимодействия или ковалентая модификация фермента. Такое ингибирование активности называется неконкурентным .

Необратимое ингибирование в большинстве случаев основано на связывании так называемых «суицидных субстратов » с активными центрами ферментов. При этом между субстратом и ферментом формируются ковалентные связи, которые расщепляются очень медленно и фермент долго не способен выполнять свою функцию. Примером «суицидного субстрата» служит антибиотик пенициллин (глава 18, рис. 18.1).

Поскольку для ферментов характерна специфичность действия, их классифицируют по типу реакции, подвергающейся катализу. Согласно принятой в настоящее время классификации, ферменты группируют в 6 классов:

1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные реакции).

2. Трансферазы (реакции переноса функциональных групп между субстратами).

3. Гидролазы (реакции гидролиза, акцептором переносимой группы является молекула воды).

4. Лиазы (реакции отщепления групп негидролитическим путем).

5. Изомеразы (реакции изомеризации).

6. Лигазы, или синтетазы (реакции синтеза за счет энергии расщепления нуклеозидтрифосфатов, чаще АТР).

Номер соответствующего класса фермента закреплен в его кодовой нумерации (шифре). Шифр фермента состоит из четырех разделенных точками чисел, обозначающих класс фермента, подкласс, подподкласс и порядковый номер в подподклассе.

Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.

А. Энергетические изменения при химических реакциях

Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии. Согласно этим законам, общая энергия химической системы и её окружения остаётся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для понимания энергетики химической реакции недостаточно знать энергетический баланс входящих и выходящих из реакции реагентов, необходимо учитывать изменения энергии в процессе данной химической реакции и роль ферментов в динамике этого процесса. Рассмотрим реакцию разложения угольной кислоты:

Н2СО3 → Н20 + С02.

Угольная кислота слабая; реакция её разложения пойдёт цри обычных условиях, если молекулы угольной кислоты имеют энергию, превышающую определённый уровень, называемый энергией активации Еа (рис. 2-10).

Энергией активации называют дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.

При достижении этого энергетического барьера в молекуле происходят изменения, вызывающие перераспределение химических связей и образование новых соединений. Говорят, что молекулы, обладающие Еа, находятся в переходном состоянии. Разницу энергий между исходным реагентом Н2СО3 и конечными соединениями Н2О и СО2 называют изменением свободной энергии реакции DG. Молекулы Н2О и СО2 - более стабильные вещества, чем Н2СО3, т.е. обладают меньшей энергией и при обычных условиях практически не реагируют. Выделившаяся энергия в результате этой реакции рассеивается в виде тепла в окружающую среду.

Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень Еа, тем выше скорость химической реакции. Повысить скорость химической реакции можно нагреванием. При этом увеличивается энергия реагирующих молекул. Однако для живых организмов высокие температуры губительны, поэтому в клетке для ускорения химических реакций используются ферменты. Ферменты обеспечивают высокую скорость реакций при оптимальных условиях, существующих в клетке, путём понижения уровня Еа. Таким образом, ферменты снижают высоту энергетического барьера, в результате возрастает количество реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции.

В механизме ферментативного катализа решающее значение имеет образование нестойких промежуточных соединений - фермент-субстратный комплекс ES, подвергающийся превращению в нестабильный переходный комплекс ЕР, который почти мгновенно распадается на свободный фермент и продукт реакции.

Таким образом, биологические катализаторы (ферменты) не изменяют свободную энергию.

Фермент, выполняя функцию катализатора химической реакции, подчиняется общим законам катализа и обладает всеми свойствами, характерными для небиологических катализаторов, однако имеет и отличительные свойства, связанные с особенностями строения ферментов.

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что:

·ферменты катализируют энергетически возможные реакции;

·энергия химической системы остаётся постоянной;

·в ходе катализа направление реакции не изменяется;

·ферменты не расходуются в процессе реакции.

Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что:

·скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами;

·ферменты обладают высокой специфичностью;

·ферментативная реакция проходит в клетке, т.е. при температуре 37 °С, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН;

·скорость ферментативной реакции может регулироваться.

Механизмы действия ферментов

В общем виде все сводится к комплементарному взаимодействию фермента и субстрата. При этом функциональные группы субстрата взаимодействуют с соответствующими им функциональными группами фермента. Наличие субстратной специфичности объясняют две гипотезы:

1. Теория Фишера (модель "жесткой матрицы", "ключ-замок") – активный центр фермента строго соответствует конфигурации субстрата и не изменяется при его присоединении. Эта модель хорошо объясняет абсолютную специфичность, но не групповую.

2. В 1958 г. Дениел Кошланд предложил модификацию модели «ключ-замок». Ферменты, в основном, - не жесткие, а гибкие молекулы. Активный центр фермента может изменить конформацию после связывания субстрата. Боковые группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое позволяет ферменту выполнить свою каталитическую функцию. В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответствия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния. Эта модель получила название «рука-перчатка».

Кинетика ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН среды, концентраций фермента, субстрата. Понятие об оптимумах рН и температуры, физиологическое и клинико-диагностическое значение. Определение константы Михаэлиса и ее клинико-диагностическое значение.

Кинетикаферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора .

Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакцийявляется получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества ферментов:

При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет зависеть от концентрации фермента. Графическая зависимость такой реакции имеет вид прямой линии.Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов.

Рис. Зависимость накопления продукта (А) и убыли субстрата (Б) от времени (продолжительности) протекания реакции. Скорость ферментативной реакции определяется изменением концентрации продукта или субстрата за единицу времени.

Период ферментативной реакции характеризуется нелинейным накоплением продукта (или убылью субстрата) в зависимости от времени реакции.

единица активности ферментов: 1 катал (кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. Количество каталов определяют по формуле:

Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами:

1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/мин = 60х10 6 мкмоль/мин = 6х10 7 ME,

1 ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

В медицинской практике для оценки активности ферментов часто используют международные единицы активности - ME. Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (пМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани:

По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды

Повышение температуры до определённых пределов оказывает влияние на скорость ферментативной реакции, подобно влиянию температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы.

Для большинства ферментов человека оптимальна температура 37-38 °С. Однако в природе существуют и термостабильные ферменты. Например, Taq-полимераза, выделенная из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, не инактивируется при повышении температуры до 95 °С. Этот фермент используют в научно-практической медицине для молекулярной диагностики заболеваний с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Рис. Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от температуры.

Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды

Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность. Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности.

Влияние рН на активность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков данного белка, обеспечивающих оптимальную конформацию активного центра фермента. При изменении рН от оптимальных значений происходит изменение ионизации функциональных групп молекулы белка. Например, при закислении среды происходит протонирование свободных аминогрупп (NH 3 +), а при защелачивании происходит отщепление протона от карбоксильных групп (СОО -). Это приводит к изменению конформации молекулы фермента и конформации активного центра; следовательно, нарушается присоединение субстрата, кофакторов и коферментов к активному центру. Кроме того, рН среды может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата, что также влияет на сродство субстрата к активному центру. При значительном отклонении от оптимального значения рН может происходить денатурация белковой молекулы с полной потерей ферментативной активности.

Оптимум значения рН у разных ферментов различный. Ферменты, работающие в кислых условиях среды (например, пепсин в желудке или лизосомальные ферменты), приобретают конформацию, обеспечивающую работу фермента при кислых значениях рН. Однако большая часть ферментов организма человека имеет оптимум рН, близкий к нейтральному, совпадающий с физиологическим значением рН.

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата

Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой.

При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции V max .

Таким образом, концентрация фермента - лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.

Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:

где k 1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k -1 - константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k 2 - константа скорости образования продукта реакции.

Следующее соотношение констант скоростей (k -1 + k 2)/k 1 называют константой Михаэлиса и обозначают К m .

Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.

Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = .

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением

Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.

В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, K m = [S] Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости.

Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно больше K m (S >> K m), to увеличение концентрации субстрата на величину К m практически не влияет на сумму (K m + S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = V max . В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что V max - величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно меньше K m (S << K m), то сумма (K m + S) примерно равна К m , следовательно, V = V max [S]/K m , т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Рис. Зависимость скорости реакции (V) от концентрации субстрата S.

V mах и K m - кинетические характеристики эффективности фермента.

· V max дает характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата. К m характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше

· К m , тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот, чем больше К m , тем меньше начальная скорость реакции, тем меньше сродство фермента к субстрату.